原代细胞培养的注意事项

　　原代细胞培养的注意事项主要包括以下几个方面：

　　

　　1、取材与处理：

　　

　　选择健康、无感染的组织或器官作为细胞来源，以确保获得高质量的原代细胞。取材操作要迅速，尽量减少组织在空气中暴露的时间，避免污染和细胞损伤。例如，对于孕鼠取材，浸泡乙醇时间应控制在1分钟左右，不能过长，以确保胚胎细胞活性。

　　

　　2、无菌操作：

　　

　　整个取材和培养过程都要严格进行无菌操作，操作要求应高于外科手术标准。使用经过灭菌的工具和试剂，实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。

　　

　　3、消化与分离：

　　

　　如果采用酶消化法，要根据组织特性选择合适的消化酶（如胶原酶、胰酶等），并控制好消化时间和温度。例如，胰酶的温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半，以避免细胞被过度消化而受损。组织块法中，组织块剪碎后接种到培养瓶壁上，要注意组织块的粘附情况，避免组织块漂浮起来影响细胞生长。

　　

　　4、培养条件：

　　

　　提供适宜的培养条件，包括温度、湿度、氧气浓度、营养物质等。一般来说，动物细胞培养的适宜温度为36.5℃±0.2℃，二氧化碳浓度为5%，相对饱和湿度为95%。培养液的选择要根据不同的细胞类型和实验要求进行。常用的有L/HDMEM、F12DMEM、RPMI1640等。

　　

　　5、观察与换液：

　　

　　定期观察细胞的生长状况，包括细胞形态、贴壁情况、是否有污染等。原代细胞在培养2天后可能会出现细胞液变黄的现象，这是正常现象，是由于细胞在贴壁生长过程中释放CO2和其他物质导致培养液PH发生改变。根据细胞的生长情况及时换液，一般48~72小时可换液一次。换液时要注意去除漂浮的组织块和残留的血细胞。

　　

　　6、传代与冻存：

　　

　　原代细胞的传代次数不宜过多，一般不超过3-5次，否则会导致细胞老化和突变。当细胞生长至80%~90%融合时，可以进行传代或冻存。冻存液的配制要根据具体的细胞类型和实验室的经验来确定，常见的配方有10%DMSO+90%胎牛血清等。

　　

　　7、细胞鉴定：

　　

　　有时候获取的原代细胞可能不是期望的细胞类型，需要进行细胞鉴定。可以通过购买特定的细胞表面标志物抗体或染色试剂来进行鉴定。

　　

　　原代细胞培养需要注意细胞的来源、处理、无菌操作、消化与分离、培养条件、观察与换液、传代与冻存以及细胞鉴定等方面。只有严格遵守这些注意事项，才能保证原代细胞培养的成功和细胞的质量。