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细胞冻存和复苏实验

发布时间: 2022-09-01  点击次数: 156次

实验方法原理

       细胞冻存和复苏的基本原理是慢冻快解冻,已被证明能最大限度地提高细胞活力。目前常用甘油或二甲基亚砜作为细胞低温保存的保护剂。这两种物质可以提高细胞膜对水的渗透性,再加上缓慢的冷冻可以使细胞内的水从细胞中渗出,减少细胞内冰晶的形成,从而减少冰晶形成对细胞的损伤。复苏细胞时应采用快速熔融的方法,以保证细胞外晶体在短时间内熔融,以避免因水缓慢熔融进入细胞形成细胞内重结晶而对细胞造成损伤。


实验材料:细胞


试剂、试剂盒:

       D-Hanks液 、小牛血清 、培养液、 青霉素、 链霉素、 胰蛋白酶、 HCl 、NaHCO3、 DMSO、 甘油


仪器、耗材:

微量加样枪吸头、 离心管、 冻存管 、枪头、 胶塞 、移液管玻璃瓶、 红血球计数板、 记号笔、 医用橡皮膏 、移液枪 、超净工作台 、离心机 、恒温水浴箱、 冰箱、 倒置相差显微镜 、培养箱 、液氮冰箱


实验步骤:

1、细胞冻存

①10%DMSO或甘油冷冻培养基的制备10~20%小牛血清。

② 对数生长期细胞用胰蛋白酶消化,悬液中生长的细胞直接移到15 ml离心管。

③离心机转速1000转,5分钟。

④除去胰蛋白酶和旧培养基,加入适量配制好的冷冻培养基。用吸管轻轻吹气使细胞均匀、计数,调整冻液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。

⑤细胞分成深低温保存管,每管1~1.5ml。

⑥低温保存管上标明细胞名称、冷冻时间和操作人员。

⑦冷冻:标准的冷冻程序是冷却速度为-1~-2°C/min。温度低于-25℃时,可提高到-5°C~-10°C / min.。在-100℃时,可快速浸入液氮中。含有细胞的冷冻保存管也可以放在-20°C的冰箱里2个小时,然后放入-70°D的冰箱中过夜。取出冷冻管并将其移到液氮容器中。

2、细胞复苏:

①将冷冻管从液氮容器中取出,直接浸入37°C温水中,并不时摇晃,使其尽快融化。

②从37°C水浴中取出冻存管,打开盖子,用移液器吸出细胞悬液,加入离心管滴下培养液10倍以上,搅拌均匀。       

③离心,1000转/分钟,5分钟。

④弃去上清液,加入10%小牛血清培养基悬浮细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37°C培养箱培养。

⑤第二天更换培养基,继续培养。


注册事项:

①从增殖期到形成致密单层细胞的培养细胞可用于低温保存,但优选对数生长期细胞。冷冻前一天最好换培养基。

②将冷冻储存管放入液氮容器或取出时,要做好防护工作,避免冻伤。。

③冷冻复苏时,最好使用新配制的培养基。






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