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从哺乳动物细胞或组织分离DNA

发布时间: 2022-09-09  点击次数: 394次

材料与仪器细胞TBS抽提缓冲液离心管

 

实验步骤

步骤1根据样品类型,从下列方法中选一个作为步骤1进行操作。

(1) 细胞样品

① 单层培养的细胞

以用冰预冷的 TBS 将单层细胞洗涤2次,用刮棒把细胞刮入约0.5ml 的 TBS 中,将细胞悬液转移到冰浴的离心管中,用1ml TBS冲洗培养皿,并入离心管中的细胞悬液。于 4℃ 以1500g离心10分钟以收获细胞。用5~10倍体积经冰预冷的 TBS 重悬细胞并再度离心。用TE ( pH 8.0)重悬细胞,使细胞密度为 5x107 细胞/ml,转移至一个三角烧瓶中(1ml 细胞悬液用 50ml 烧瓶;2ml 则用100ml烧瓶;余类推)。每毫升细胞悬液加入10ml抽提缓冲液,在37℃孵育1小时,随后进行步骤2。

 

抽提缓冲液:

10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0

0.1 mol/L EDTA,pH 8.0

20 ug/ml 胰 RNA 酶

0.5% SDS

 

② 悬浮生长的细胞

4℃ 以 1500 g 离心 10 分钟以收获细胞。用与原培养液等体积的经过冰预冷的 TBS 重悬细胞,再次离心收获细胞并重复洗涤步骤。用 pH 8.0 的 TE 重悬细胞使密度为 5x107 细胞/ml。将悬液转移至大小适当的烧瓶中,依前听述加入抽提缓冲液并孵育。

 

(2) 组织标本

将刚切制的组织碎块放到盛有液氮的 Waring 绞切器的不锈钢杯中,以最高速度绞切至组织粉碎成为粉末。待液氮蒸发,将组织碎末一点一点地加入到盛有近 10 倍体积抽提缓冲液(如前)的烧杯中。使粉末分散在抽提缓冲液的表面,面后振摇烧杯使粉末浸没。待其完全分散于溶液中后,将该溶液转移至 50 ml 离心管中,37℃ 孵育 1 小时。随后进行步骤 2。

 

(3) 血液标本

收集约 20 ml 新鲜血液,加入装有 3.5 ml 酸性柠檬酸葡萄糖溶液 B ( ACD ) 的试管中 。这一抗凝剂优于 EDTA,因为它在血液贮存过程中更能保存高分子量 DNA。这些血液在制备 DNA 前可于 0℃ 保存数天或于 -70℃ 长期保存。配制 ACD 时,混合:

柠檬酸0.48g

柠檬酸钠1.32g

葡萄糖1.47g

加水至100 ml

用作抗凝剂时,每6ml新鲜血液中加入1ml ACD。

 

新鲜血液(20 ml):以 1300g离心15分钟,弃上层血浆,用巴斯德吸管将淡黄层小心移到另一管中并再次离心。淡黄层即为密度不均一的白细胞宽带。将经第二次离心的淡黄层重悬于15ml抽提缓冲液中,37℃孵育1小时,随后进行步骤2。

 

冻藏血液(20 ml):在室温水浴中融化,移至离心管中,用等体积 PBS 稀释;随后于室温以 3500 g离心15分钟并弃去上清液,其中含有已溶解的红细胞用15ml抽提缓冲液重悬沉淀物;37℃孵育1小时,随后进行步骤2。

 

步骤2蛋白酶K至终浓度为100ug/ml,用玻棒温和地将酶混入黏稠的溶液中。

 

步骤3裂解细胞的悬液置于50℃ 水浴中3小时,不时悬动该黏稠溶液。

 

步骤4溶液冷却至室温,如有必要就将溶液倒入离心管。加等体积经 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)平衡的酚,缓慢地来回颠倒离心管 10 分钟以轻轻地混合两相 。如此时两相未能混合形成乳浊液,则将离心管置于旋转器上 1 小时,于室温以 5000 g 离心 15 分钟,使两相分开。

 

步骤5大口径移液管(出口直径为 0.3 cm ) 将黏稠的水相移至一洁净的离心管中并用酚重复抽提 2 次。

 

步骤6分离高分子量DNA(约200kb):第三次酚抽提后用全部水相于4℃对4L 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)、10 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液透析4次,直至透析液的 OD270 值小于0.05。让透析袋留有使样品体积增至1.5~2.0倍体积的空间。下转步骤7。

 

分离大小为 100~150kb的 DNA:第三次酚抽提后,将全部水相移至另一离心管中并加0.2倍体积的 10mol/L 乙酸铵。在室温下加 2 倍体积乙醇并转动离心管使溶液充分混合。DNA立即形成沉淀,通常可用制成 U 形并经封口的巴斯德吸管将沉淀从乙醇溶液中移出。而大部分污染的寡聚核糖核苷酸仍留在乙醇溶液中。如果DNA沉淀成为碎片,则在吊桶式转头中于室温以 5000 g 离心 5 分钟收集 DNA。用 70% 乙醇洗涤DNA沉淀2次,并按上述条件离心收集 DNA。尽可能彻底地除去70%乙醇,于室温将DNA沉淀置于一个敞幵的管内,直至可见的痕量乙醇挥发殆尽。不要使DNA沉淀完全干燥,否则极难溶解。

 

大约按每 5x106 细胞加 1ml TE (pH 8.0 )。将管子放在摇床平台上慢慢摇动直至 DNA 完全溶解。这通常需要12~24小时。

 

步骤7测定 DNA 样品在 260 nm 和 280 nm 处的光吸收。A260 与 A280 之比应大于 1.75。低于此值则表明制备物中留有大量蛋白质。在这种情况下,应加入 SDS 至终浓度为 0.5%,并重复步骤 2~7。

 

步骤8 计算 DNA 浓度,进行脉冲电场凝胶电泳或通过铺在1%琼脂糖支持层上的0.3%琼脂糖凝胶电泳分析小量样品。大于100kb的DNA,其迁移率应该比完整的噬菌体 DNA 的线性二聚体分子慢。将 DNA 贮存在4℃。

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