更新时间：2024-11-19
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慢性糖尿病伤口主要由感染、炎症和血管生成相关疾病引起。治疗慢性糖尿病伤口的理想方法是结合抗感染策略、免疫微环境调节和促进血管生成。血管内皮生长因子（VEGF）可以促进血管内皮细胞的增殖和迁移，从而促进血管生成。然而，其稳定性低，不能靶向病灶，限制了其应用。多形核中性粒细胞衍生外泌体（PMNExo）具有良好的递送特性，可用于VEGF的治疗递送，此外，它们还保留了多形核中性粒细胞（PMN）的抗菌能力。然而，低PMNExo生成阻碍了其治疗应用。本文作者Yanzhen Yu等采用了挤压法制备了PMNs外泌体模拟物（EM），成功在Journal of Nanobiotechnology上发表篇名为An injectable, activated neutrophil-derived exosome mimetics/extracellular matrix hybrid hydrogel with antibacterial activity and wound healing promotion effect for diabetic wound therapy的研究成果，将VEGF封装的活化中性粒细胞外泌体模拟物（aPMNEM）装入ECM，以开发用于治疗慢性伤口的VEGF-aPMNEM-ECM混合水凝胶。下面小编带大家了解一下本文的主要研究成果。
01：VEGF-aPMNEM-ECM混合水凝胶的制备与表征
在本研究中，作者将VEGF封装的活化中性粒细胞外泌体模拟物（aPMNEM）装入ECM，以开发用于治疗慢性伤口的VEGF-aPMNEM-ECM。首先对纳米材料进行合成，而后验证aPMNEM的质量，作者使用了TEM，Western blotting, NTA和Zeta电位测量进行了表征。TEM和NTA结果显示，aPMNEM的直径约为160nm，与PMNExo、aPMNExo和PMNEM的大小相似。Zeta电位测量显示，aPMNEM的电位约为-40 mV，与PMNExo、aPMNExo和PMNEM的表面膜电位相似。为了量化aPMNEM的产量，作者测量了由相同数量的细胞通过NTA产生的PMNExo、aPMNExo、PMNEM和aPMNEM的数量。NTA显示，通过多层过滤挤出生产的aPMNEM产量约为aPMNExo产量的10倍。接下来，为了研究aPMNEM的质量，作者进行了4D无标记定量蛋白质组学分析，并通过主成分分析（PCA）、火山图分析和热图分析比较了aPMNEM和PMNExo的蛋白质含量。PCA显示aPMNEM和PMNExo蛋白含量不同。此外，蛋白质组学分析发现，与PMNExo相比，aPMNEM中有1807种不同的蛋白质类型具有显著差异。与PMNExo相比，aPMNEM中差异表达的蛋白中有1501个蛋白上调（折叠变化>2），306个蛋白下调（折叠变化>2）。GO注释分析显示aPMNEM与PMNExo具有相似的生物过程、细胞成分和分子功能。在杀菌相关蛋白中，中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白（LCN2）、溶菌酶（LYZ）和肽聚糖识别蛋白（PGLYRP1）上调，而补体C3（C3）、髓过氧化物酶（MPO）和补体C4-B（C4B）在PMNEM中与PMNExo相比下调。最后作者通过物理冷冻结合SDS-Triton洗脱法制备了温度敏感的ECM水凝胶。
02：aPMNEM分子清创
作者通过4D无标记定量蛋白质组学进行分析，分析其蛋白质含量来确定aPMNEM的组成。结果显示，aPMNEM含有3386个蛋白，通过分子功能分析发现，这些蛋白参与了氧化还原酶的活性，这可能是aPMNEM具有抗菌活性的原因之一。而后为了验证aPMNEM的抑菌能力，作者首先在体外研究了aPMNEM对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌落生长抑制作用。研究结果表明，aPMNEM处理3小时可有效抑制体外培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，破坏细菌细胞壁结构。随后，用aPMNEM治疗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染的大鼠伤口。组织的Giemsa结果显示，aPMNEM成功地抑制了细菌在体内的生长，这与aPMNEM体外抑菌试验的结果相吻合。为了评估aPMNEM的抗炎作用，作者测定了对照组和aPMNEM组感染创面和血浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6水平在24和48 h时的变化。qPCR结果显示，对照组和aPMNEM组感染创面中炎症因子水平在24 h时无显著变化。
03：VEGF-aPMNM - ECM对体内重要器官的影响及生物分布
为了验证VEGF-aPMNM-ECM的生物相容性，作者通过H&E染色法观察这些器官的生理结构变化。结果显示，与PBS处理的对照组相比，VEGF-aPMNM-ECM对SD大鼠全层皮肤创面模型无明显的病理改变，说明VEGF-aPMNM-ECM对SD大鼠全层皮肤创面模型无毒性作用。同时使用了小动物体内成像验证VEGF - aPMNEM在创面的生物分布，显示出aPMNEM在伤口部位保持48小时的功能，并且不随时间扩散。
04：VEGF-aPMNEM-ECM在皮肤伤口愈合中的体内体外应用能力探究
作者建立大鼠全层皮肤创面模型，并给予多种治疗。结果显示，与其他治疗方法相比，VEGF-aPMNEM-ECM治疗可能更能促进创面愈合。治疗14天后取出创面组织，进行H&E和Masson染色、免疫组化分析和免疫荧光（IF）分析。H&E染色结果证实，四组中VEGF-aPMNEM-ECM处理伤口边缘最短，上皮化程度最高。Masson染色结果显示，与其他三组相比，VEGF-aPMNEM-ECM组伤口部位胶原沉积最多，胶原排列更有序。通过CD31和α-SMA抗体的免疫组化和IF 分析，VEGF-aPMNEM-ECM治疗组血管数量最多，其次是ECM和aPMNEM-ECM治疗组，PBS治疗组血管数量较少。这些结果表明VEGF-aPMNEM-ECM通过促进血管生成来促进皮肤伤口愈合。为了证实VEGF-aPMNEM-ECM对内皮细胞血管生成的治疗潜力，作者使用VEGF-aPMNEM-ECM进行了血管形成实验。结果表明，VEGF-aPMNEM-ECM促进了血管内皮细胞向血管的转化，VEGF-aPMNEM-ECM组血管总长度和支管长度最长。
VEGF-aPMNEM-ECM在皮肤伤口愈合中的体内体外应用能力探究
05：VEGF-aPMNEM-ECM对炎症微环境的体内调节作用
VEG为了确定ECM的组成，作者通过进行4D无标记定量蛋白质组学分析来分析ECM的蛋白质含量。在ECM水凝胶中共发现112种蛋白质。生物信息学研究揭示了ECM与“细胞外成分"之间的相关性。根据以往的研究，那些数量较多的蛋白，如胶原I，可使M1巨噬细胞转化为M2巨噬细胞。CD86 (M1巨噬细胞表面标记物)和CD206 (M2巨噬细胞表面标记物)抗体IF分析结果证实，ECM、aPMNEM - ECM和VEGF-aPMNEM-ECM治疗组显著诱导M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转化；但三组间无明显差异。
综合实验结果我们不难看出，此研究成功开发了一种新型的VEGF-aPMNEM-ECM生物材料，用于治疗慢性糖尿病伤口。该材料利用PMN衍生的外泌体模拟物作为载体，保护VEGF免受降解，并通过ECM水凝胶延长其在伤口部位的驻留时间，且在促进伤口愈合方面显示出良好的生物相容性和生物安全性。作者团队研究开发的VEGF-aPMNEM-ECM纳米材料为糖尿病创伤治疗提供了一个有前景的平台，通过在aPMNEM-ECM中加载各种可用的细胞因子，有潜力应用于不同疾病的治疗，为糖尿病伤口治疗提供了新的策略。
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