基于葡聚糖硫酸盐纳米光敏剂靶向肿瘤相关巨噬细胞的光动力抗癌疗法

肿瘤中存在的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的M2样表型促进肿瘤生长和转移。因此，靶向M2样TAM是一种潜在的癌症治疗策略。然而，针对M2巨噬细胞的全身治疗可能会抑制肿瘤组织中的TAM以及在正常过程中起关键作用的其他M2巨噬细胞，导致免疫功能低下状态的风险增加。光动力疗法（PDT）是一种非侵入性的局部癌症治疗方法，通过联合使用光敏剂和无害光产生活性氧（ROS），诱导膜损伤和细胞凋亡。重要的是，PDT的治疗效果仅限于光治疗的肿瘤区域。因此，在不影响正常巨噬细胞的情况下，局部PDT是一种很好的癌症治疗选择。本文作者Kyeongsoon Park将二者进行结合，在International Journal of Biological Macromolecules（IF=8.5，一区）上发表题名为Tumor-associated macrophage-targeted photodynamic cancer therapy using a dextran sulfate-based nano-photosensitizer的研究成果，制备了一种基于葡聚糖硫酸盐的纳米光敏剂（葡聚糖硫酸盐二氢卟吩e6, DS-Ce6），专门针对M2样TAM进行增强光动力治疗（PDT），从而用于抑制肿瘤的生长和转移。

DS-Ce6是由DS（SR-A的特异性配体）与Ce6（光敏剂）化学偶联合成的，作者通过UV/Vis和FT-IR分析证实了DS-Ce6的合成，并使用粒径分析测量了DS-Ce6的粒径大小和分布，最后进行了单线态氧1O2的生成测试，在670 nm连续波激光照射下，使用单线态氧传感器检测DS-Ce6产生的单线态氧的量，以评估光动力疗法的效果。通过这些合成和表征步骤，作者能够确保DS-Ce6具有预期的化学结构、粒径和光敏性，使其能够有效地被M2型TAMs摄取并在光照下产生细胞毒性的活性氧（ROS），从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。随后作者验证了M2巨噬细胞SR-A的表达情况，在巨噬细胞的极化状态中，M2巨噬细胞通常由IL-4和IL-13诱导，通过表达MRs （CD206）和SRs （SR-A, CD204）来识别。Western blot分析结果表明，IL -4衍生的M2巨噬细胞剂量依赖性地增加SR-A的表达。

作者在本实验研究了DS-Ce6对IL -4处理的巨噬细胞和共培养的4T1/巨噬细胞的体外细胞毒性。结果表明，在所有测试组中，IL -4处理的巨噬细胞的细胞存活率> 95%。经DS-Ce6或未经激光处理的Ce6共培养细胞毒性可忽略不计，这意味着未经激光处理的DS-Ce6不发挥细胞毒性作用。而后作者在共培养的4T1/巨噬细胞中检测了IL-4处理的巨噬细胞对游离Ce6和DS-Ce6的细胞内摄取以及DS-Ce6与巨噬细胞的特异性结合。在IL-4处理的巨噬细胞中，DS-Ce6的细胞摄取高于游离Ce6；此外，在IL-4处理的巨噬细胞中，DS-Ce6的内化比正常巨噬细胞强得多。数据表明，IL-4诱导的M2巨噬细胞上调SR-A的表达，且DS-Ce6进入M2巨噬细胞是通过特异性结合SR-A介导的。

作者通过生物发光成像来评估DS-Ce6在激光照射下对共培养4T1-Luc/巨噬细胞的体外光疗作用。数据表明，DS-Ce6处理后共培养细胞中4T1细胞的BLI明显降低，且呈剂量和激光照射时间依赖性。此外，在DS-Ce6处理的4T1/巨噬细胞共培养中，即使激光照射时间较短，4T1细胞的BLIs也明显低于Ce6处理组。而后作者评估了Caspase-3和下游PARP的水平，因为Caspase-3可被来自内在和外在途径的刺激激活造成凋亡，Western blot分析进一步证实了DS-Ce6光激活后4T1-Luc/巨噬细胞凋亡且定量数据显示，与Ce6处理的共培养细胞相比，激光照射下，DS-Ce6处理的共培养细胞中Caspase-3和PARP的表达水平增加。CLSM图像证实，在共培养细胞中，DS-Ce6比Ce6能特异性靶向且更内化DS-Ce6进入M2样巨噬细胞。将DS-Ce6内化到M2样巨噬细胞中，在激光照射下产生细胞毒性1O2，产生的1O2有效诱导M2样巨噬细胞和肿瘤细胞凋亡，导致共培养组4T1细胞BLI降低。这些结果表明，DS-Ce6也能有效诱导4T1/巨噬细胞共培养的肿瘤细胞凋亡。

PDT药物通常对细胞单层表现出体外光疗作用。然而，单层细胞培养模型在复制和模拟实体肿瘤的缺氧条件、病理生理和多细胞耐药方面存在局限性。因此，作者使用4T1/巨噬细胞的3D球体进一步评估DS-Ce6的光疗潜力。从结果可以看出，未经激光照射的Ce6或DS-Ce6处理后的三维球体保持了三维球体的形态。然而，在激光照射下，DS-Ce6治疗组三维球体的形态学变化比Ce6组更显著，证实了DS-Ce6对三维球体的光疗效果要强得多。

作者采用全身荧光法检测Ce6和DS-Ce6在体内的生物分布。结果表明在注射后最初1-2小时，Ce6处理小鼠全身可见较强的荧光强度，此后荧光强度迅速下降。注射后12小时，在游离Ce6处理小鼠中观察到微弱的荧光信号，这意味着大部分Ce6从体内清除。相比之下，在注射后最初1-3小时，DS-Ce6处理小鼠的荧光信号相对较低，此后荧光信号逐渐减弱，但在24小时内全身仍可见。由于DS-Ce6与Ce6相比血液循环更长，因此在注射后12小时，DS-Ce6在肿瘤组织中的积累量相对高于游离Ce6。通过实验结果作者证实了M2巨噬细胞在肿瘤组织内的分布，证明了DS-Ce6对M2巨噬细胞的靶向能力。

荧光结果显示，DS-Ce6处理组的荧光信号强于游离Ce6处理组，表明DS-Ce6对M2巨噬细胞的靶向能力高于游离Ce6，这是由于DS-Ce6与M2样TAM上过表达的SR-A特异性结合。同时，观察到大量F4/80(绿色)和CD206(蓝色)双阳性巨噬细胞，F4/80和CD206在4T1肿瘤组织内共定位良好，表明M2巨噬细胞在肿瘤组织中浸润分布丰富。更重要的是，F4/80和CD206阳性的M2巨噬细胞与DS-Ce6的荧光信号匹配良好，表明DS-Ce6可以特异性靶向肿瘤组织内的M2样TAM。