细胞凋亡检测基于形态学的方法要怎么操作？

　　凋亡或者说程序性细胞死亡，是细胞内建的防御机制之一，在生物的正常发育及疾病抵御中起到重要的作用。凋亡过程与通路的异常，会导致多种疾病，包括肿瘤。目前至少有十数种检测细胞凋亡的方法，从大框架上讲，可以划分为基于细胞形态、生物学功能和生化标记三大类。那么细胞凋亡检测基于形态学的方法是怎么操作的呢？

　　

　　1、电子显微镜检查

　　

　　“凋亡”是一个细胞形态学概念。因此，鉴定凋亡的金指标，往往是基于形态学的。凋亡和另外一种主要的细胞死亡类型“坏死”有着显著的亚细胞形态差异。简而言之，在透射电镜下，凋亡细胞染色质浓聚，通常沿核膜分布；整体细胞形态发生变化，如细胞表面微绒毛状突起消失，细胞间接触消失，细胞质浓聚，形成具有膜结构的包裹着胞浆内容物和核物质的凋亡小体；相比坏死，凋亡细胞的核结构直到晚期才会解体。

　　

　　尽管电镜检查是细胞凋亡检测的金标准，然而其缺点也很明显：无法定量（电镜一个视野仅能观察一两个细胞），实验步骤繁琐（固定、切片到拍照），同时，并非所有实验室都能接触到电镜。因此，对于不专门研究凋亡这种细胞现象的实验室来说，基本没有人选择电镜来检测凋亡了。好在目前的主流期刊，也是接受不含电镜的凋亡数据。

　　

　　2、细胞核形态染色

　　

　　既然凋亡细胞其中一个形态学特征是染色质浓聚，且细胞核结构在凋亡后期崩解，那么观察核形态也是较为直接的指标。相比其他形态学指标来说，观察细胞核形态不需要电子显微镜，而只需用荧光染料配合普通的荧光显微镜即可。

　　

　　一般而言，核形态染色采用的是DAPI和Hoechst系列荧光染料。因为这些染料特异性强，荧光性能好。其中，Hoechst33342是最为方便的染料。它可自由穿透细胞膜，直接对核染色，而不需要固定、破膜步骤。因此，Hoechst33342还能结合形态学的相差图像，以及其他活细胞染料（如用7-AAD等染细胞膜破裂的细胞），同时对多个指标进行定量。

　　

　　除了实验操作简单、成本低廉之外，核形态染色的优势还在于它是一个定量指标。因此，这也是我常用的细胞凋亡检测指标之一。不过，定量依赖于拍摄照片后对多个视野的不同核形态手动计数。