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细胞凋亡检测基于形态学的方法要怎么操作?

发布时间: 2022-06-22  点击次数: 8次
  凋亡或者说程序性细胞死亡,是细胞内建的防御机制之一,在生物的正常发育及疾病抵御中起到重要的作用。凋亡过程与通路的异常,会导致多种疾病,包括肿瘤。目前至少有十数种检测细胞凋亡的方法,从大框架上讲,可以划分为基于细胞形态、生物学功能和生化标记三大类。那么细胞凋亡检测基于形态学的方法是怎么操作的呢?
  
  1、电子显微镜检查
  
  “凋亡”是一个细胞形态学概念。因此,鉴定凋亡的金指标,往往是基于形态学的。凋亡和另外一种主要的细胞死亡类型“坏死”有着显著的亚细胞形态差异。简而言之,在透射电镜下,凋亡细胞染色质浓聚,通常沿核膜分布;整体细胞形态发生变化,如细胞表面微绒毛状突起消失,细胞间接触消失,细胞质浓聚,形成具有膜结构的包裹着胞浆内容物和核物质的凋亡小体;相比坏死,凋亡细胞的核结构直到晚期才会解体。
  
  尽管电镜检查是细胞凋亡检测的金标准,然而其缺点也很明显:无法定量(电镜一个视野仅能观察一两个细胞),实验步骤繁琐(固定、切片到拍照),同时,并非所有实验室都能接触到电镜。因此,对于不专门研究凋亡这种细胞现象的实验室来说,基本没有人选择电镜来检测凋亡了。好在目前的主流期刊,也是接受不含电镜的凋亡数据。
  
  2、细胞核形态染色
  
  既然凋亡细胞其中一个形态学特征是染色质浓聚,且细胞核结构在凋亡后期崩解,那么观察核形态也是较为直接的指标。相比其他形态学指标来说,观察细胞核形态不需要电子显微镜,而只需用荧光染料配合普通的荧光显微镜即可。
  
  一般而言,核形态染色采用的是DAPI和Hoechst系列荧光染料。因为这些染料特异性强,荧光性能好。其中,Hoechst33342是最为方便的染料。它可自由穿透细胞膜,直接对核染色,而不需要固定、破膜步骤。因此,Hoechst33342还能结合形态学的相差图像,以及其他活细胞染料(如用7-AAD等染细胞膜破裂的细胞),同时对多个指标进行定量。
  
  除了实验操作简单、成本低廉之外,核形态染色的优势还在于它是一个定量指标。因此,这也是我常用的细胞凋亡检测指标之一。不过,定量依赖于拍摄照片后对多个视野的不同核形态手动计数。
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