CUT&TAG靶向切割与标签化

一、技术简介

CUT&TAG是一种基于抗体引导的靶向染色质切割与标签化的高灵敏度表观基因组分析技术，该技术克服了传统ChIP-seq的 低灵敏度、高背景噪音、样本需求量大等瓶颈，可在单细胞水平解析组蛋白修饰、转录因子结合等染色质特征，成为表观遗传学研究的新方向。

二、技术原理

CUT&TAG通过 四步关键反应 实现精准染色质分析：

1. 抗体靶向定位：特异性一抗（如H3K4me3抗体）结合目标染色质区域，Protein A/G二抗携带Tn5转座酶复合物（含测序接头）。

2. 靶向切割与标签化：Tn5转座酶在抗体指引下，对目标染色质进行 DNA双链切割与接头连接，切割范围：目标位点两侧各约50-300 bp。

3. DNA片段释放：蛋白酶K消化染色质交联，释放带接头的DNA片段。

4. 文库构建与测序：PCR扩增目标片段，构建Illumina测序文库，测序深度：~20 million reads/sample（比ChIP-seq减少50%）。

三、应用场景

CUT&TAG在单细胞水平揭示肿瘤微环境中不同亚群的表观遗传差异。

例如：

1.三阴性乳腺癌：通过单细胞CUT&TAG发现FOXA1调控的超级增强子在基底样亚型中特异性激活，这些增强子驱动了EMT（上皮-间质转化）关键基因（如SNAI1）表达，促进转移。

2.急性髓系白血病：追踪复发患者骨髓样本，鉴定出CD34+干细胞中H3K4me1修饰的动态变化，这些变化预示化疗耐药性的产生，为表观靶向治疗提供新靶点。

3.胚胎发育表观重编程：CUT&TAG可追踪早期胚胎发育中组蛋白修饰的动态建立过程。

4.小鼠着床前胚胎：发现H3K9me3在2-cell阶段开始沉积，优先标记逆转录转座子区域（如LINE-1），这种修饰通过抑制转座子活性维持基因组稳定性。

5.人类胚胎干细胞：绘制H3K27ac在神经分化中的动态图谱，定位SOX2和OCT4调控的增强子网络，揭示多能性退出关键节点。

6.免疫细胞功能调控：解析T细胞分化与功能状态的表观基础。

7.T细胞耗竭：在慢性病毒感染模型中，发现耗竭性CD8+ T细胞的H3K27ac在PD-1和TIM-3基因座异常富集，这些增强子活性受TOX转录因子直接调控。

8.调节性T细胞（Treg）：联合ATAC-seq揭示FOXP3通过重塑H3K4me3修饰，稳定Treg细胞的抑制性功能，该过程依赖EZH2介导的H3K27me3协同抑制。

四、技术优势

1.较高灵敏度（100细胞级检测）：Tn5转座酶直接在目标位点切割并连接测序接头，避免ChIP-seq中DNA片段化（超声破碎）造成的随机损失。与ChIP-seq相比，CUT&TAG的信噪比提升8倍（S/N=12:1 vs 1.5:1），检测到的差异峰数量增加40%。

2.单碱基分辨率与精准定位：抗体-Tn5复合物仅切割结合位点附近DNA（±50 bp），而ChIP-seq的超声破碎产生200-500 bp随机片段。在p53结合位点分析中，CUT&TAG检测到单个狭窄峰（峰宽≈30 bp），而ChIP-seq呈现宽峰（峰宽≈200 bp），前者可精确定位到TTGCCT基序中心。

3.单细胞与空间表观组学兼容性：联合10x Genomics平台，通过微流控将单个细胞与抗体-Tn5复合物包裹在油滴中，已实现单细胞H3K27ac图谱构建（Nature Methods, 2022）。

4.最新开发的Spatial CUT&Tag技术可在组织切片上定位H3K4me3的亚结构分布，例如在小鼠脑切片中可视化海马区神经元活性相关修饰。

五、样本类型

新鲜细胞（贴壁细胞/悬浮细胞）、冻存细胞、冻存组织。

六、样本需求

细胞样本：约10,0000个（可以是24孔板的1孔，或以悬浮细胞形式存储于离心管中）；

冻存组织：约10-20mg。

七、样本准备&运输

活细胞样本：距离较近的可提供新鲜样本，将培养在皿/离心管内的新鲜细胞样本常温快递（最迟次日达）运输，本市内可闪送或亲自递送；距离较远的，可-80℃冻存细胞干冰运输；

组织样本：-80℃冻存干冰运输。

八、需提供的试剂

ChIP级抗体（没有时也可以选择IF级抗体）

九、实验周期

1-2周（不包含测序）

十、其他

后续检测Rrealtime PCR/测序