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常用的细胞凋亡检测方法【大盘点】

发布时间: 2021-09-22  点击次数: 1193次

细胞凋亡

人体内的细胞注定是要死亡的,有些死亡是生理性的,有些死亡则是病理性的,有关细胞死亡过程的研究,已成为生物学、医学研究的一个热点。已知的细胞死亡方式起码有两种,即细胞坏死与细胞凋亡(apoptosis)细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式,而细胞凋亡则是逐渐被认识的一种细胞死亡方式。

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此图片来源于网络

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型,而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。凋亡是多基因严格控制的过程,这些基因在种属之间非常保守,如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等,能够诱发细胞凋亡的因素很多,如射线、药物等。

检测方法

细胞发生凋亡时,不同区域内(如细胞膜、细胞浆、线粒体、细胞核等)会发生不同的生理生化改变。因此,针对不同区域的细胞凋亡检测要采用不同的方法

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1)Annexin V 凋亡检测

原理:Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白,正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,细胞发生凋亡早期,膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白,与PS有高度亲和力,它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。该方法通常结合式细胞术一起使用。

2)线粒体膜电位分析(JC-1)

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位,线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。
原理:在线粒体膜电位较高时,JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以产生红色荧光(Ex/Em = 585/590);在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体(monomer),可以产生绿色荧光(Ex/Em = 510/527 nm)。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。

3)Caspase活性检测

Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节,其激活主要包括线粒体依赖途径和死亡受体介导的信号转导途径。
原理:激活后的下游 Caspase,通过切割特异性底物,导致细胞凋亡。Caspase的活化是导致细胞凋亡的中心环节,细胞凋亡功能的抑制将导致肿瘤的发生及免疫功能的异常,而细胞凋亡功能亢进与组织损伤和器官功能衰竭的发病密切相关。

4)TUNEL凋亡检测

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧尿苷三磷酸核苷酸(dUTP)和荧光素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,称为TUNEL法。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。由此,TUNEL是检测DNA的片段化(细胞凋亡)常用方法。
细胞凋亡是生命的基本现象,是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞,保证了胚胎的正常发育;在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞,保证了机体的健康。和细胞增殖一样细胞凋亡也是受基因调控的精确过程。
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