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GST pull down实验技术

发布时间: 2021-09-23  点击次数: 1198次

GST Pull down实验技术

1. 实验原理

Pull down技术是将"诱饵"蛋白与一种易于纯化的配体标签(如:GST标签、His标签)进行融合表达,而带标签的诱饵蛋白能被特异结合该标签的固相亲和配基捕获,形成"次级亲和支持物",用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。纯化产物洗脱后,经Western blot验证或LC-MS/MS,即鉴定与诱饵蛋白互作的蛋白。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此,GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有谷胱甘肽(GSH)的色谱柱时,就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱,就可以得到能够与“诱饵"蛋白相互作用的兴趣蛋白。GST pull down是一种体外验证或筛选互作蛋白的技术

GST pull-down.jpg

2. 实验流程

图片1.png

  1. 构建带标签的诱饵蛋白原核表达载体(带GST标签或His或);

  2. 载体转化大肠杆菌,表达诱饵蛋白(关键步骤,很多蛋白原核表达时会形成包涵体,极大地影响后续实验。我们采用自诱导培养基培养细菌,能有效降低包涵体的形成);

  3. 细菌裂解液过柱子,带标签的诱饵蛋白被特异结合标签的固相化亲和配基捕获,产生"次级亲和支持物";

  4. 待测样品裂解液过柱子孵育,与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物"吸附;

  5. 清洗,离心,去除未结合的杂蛋白;

  6. 洗脱,得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物;

  7. 如要验证某个蛋白X与诱饵蛋白互作,则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育,做Western blot验证;

  8. 如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白,则将6.所得的蛋白复合物进行LC-MS/MS鉴定。

3. 技术服务

  1. 原核表达载体构建;

  2. 融合蛋白的诱导表达和纯化;

  3. pull down捕获互作蛋白;

  4. Western blot验证(两种目标蛋白互作/两种蛋白互作的结构域);

  5. LC-MS/MS鉴定可能的互作蛋白。

4. 交付结果

  1. 客观公正的实验原始数据和分析结果;

  2. 提供详细、完整的实验报告。

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