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细胞培养

细胞培养

简要描述:细胞培养是指从动物活体体内取出组织,于模拟体内生理环境等特定的体内条件下,进行孵育培养,使之生存并生长。该技术现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域。培养过程中,涉及到多个基本实验操作,例如:复苏、换液、传代、冻存等。

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所属分类:细胞培养

更新时间:2021-10-19

厂商性质:代理商

详情介绍

一、产品介绍

细胞培养也叫细胞克隆技术,在生物学中的正规名词为细胞培养技术。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。细胞的生长需要营养环境,用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。

细胞培养是指从动物活体体内取出组织,于模拟体内生理环境等特定的体内条件下,进行孵育培养,使之生存并生长。细胞培养现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域。

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二、过程介绍

细胞培养过程中,涉及到多个基本实验操作,例如:复苏、换液、传代、冻存等。

复苏

1.把冻存管从液氮中取出来,立即投入37℃水浴锅中,轻微摇动(注意防止盖子不紧致使液体进入冻存管)。液体都融化后(大概1-1.5分钟),拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍,把粘在壁上的细胞都洗下来),1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉,加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动,使培养皿中的细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等,放到37℃的5%CO2培养箱中培养。

5.根据细胞增长速度2-3天换一次培养基。



换液(以贴壁细胞为例)

1.培养一段时间后,细胞还未长满,而细胞培养基颜色由红色逐渐变黄,说明培养基中营养物质不足,需要及时换液。

2.吸掉原有培养基。

3.加入等体积新的完全培养基。

4.放到37℃的5%CO2培养箱中继续培养。

5.培养过程中,要定期观察细胞状态。如果细胞密度达到80%-90%需要准备传代。


传代(以贴壁细胞为例)

1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。

3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行),消化1-2分钟。

4.细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞,让细胞悬浮起来。

6.把细胞吸到10ml或15ml的离心管中,1000转离心5分钟。

7.倒掉上清液,加1-2ml培养基,把细胞都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中,一般1: 2~3传代。


冻存

把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来,分装到灭菌的冻存管中,静止几分钟,写明细胞种类,冻存日期。4℃ 30min,-20℃ 30min,-80℃ 过夜,然后放到液氮灌中保存。

冻存液的配制:80%的完全培养基+10�S+10%DMSO。注意:DMSO要慢慢滴加,边滴边摇。


三、根据细胞生长的恃点,需要选择不同方法进行细胞传代

◆ 贴壁生长的细胞用消化法传代;

◆ 部分贴壁生长(半悬浮生长)的细胞用直接吹打可传代;

◆ 悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打传代。

1.  贴壁细胞的消化法传代:

1)先吸除或倒掉瓶内旧培养液。

2)D-Hanks液洗2~3次。

3)向瓶内加入适量消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面。(注意:胰蛋白酶要预温,温度37℃左右为宜。)

4)消化最好在37℃环境下进行,消化2~5 min 后把培养瓶放置显微镜下进行观察,发现胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即终止消化。

5)吸除或倒掉消化液,如用EDTA消化,需加Hanks液数毫升,轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉,再添加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液,终止消化。

6)用弯头吸管,吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞。从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有底部都被吹到,使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔,不要用力过猛。

7) 细胞计数后分别接种在新的培养瓶内。

8)置于37℃细胞培养箱培养。(注意:要定时观察细胞,如发现污染,应及时处理。)


2.  悬浮细胞的传代:悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代,或直接传代。

离心传代法:

1) 将细胞连同培养液一并转移到15 ml 离心管内。

2) 800~1000 rpm离心5 min。(注意:离心转速要合适。转速过低,不能有效分离细胞;离心速度过大,时间过长,会挤压细胞造成损伤甚至死亡。)

3) 弃去上清,加新的培养液到离心管内,用吸管吹打形成细胞悬液。

4) 计数,分别接种在新的培养瓶内。

直接传代法:让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后,将上清液吸掉1/2~2/3,然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。


3.  部分贴壁细胞的传代

1)部分贴壁不牢的细胞,如Hela细胞等,不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来,而进行传代。

2)对绝大部分贴壁生长的细胞,因直接吹打对细胞损伤较大,细胞常有较大数量的丢失,因而需消化后,才能吹打传代。


四、细胞培养优缺点

优点:

1)能长期传代,保持活性,便于监控检测结构功能和生命活动。

2)培养条件可以人为的控制便于研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响

3)可用于各种观察和检测手段研究活细胞的变化(变异、分化)。可从细胞水平开展亚细胞结构和代谢分子的表达。

4)研究范围和细胞来源广泛,选择性广。

5)不同代次细胞可长期保存,既可开展同代次不同条件和方法研究,又可观察不同代次的动态变化。

6)耗资少、经济、成本低、可大量培养,利于生物制品的生产。

缺点:

细胞或组织生长在人工环境中,与体内环境存在差异,细胞或组织的形态或功能会发生不同程度的改变。

 



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